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    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒處理方法

    發(fā)布時(shí)間: 2014/6/4  點(diǎn)擊次數(shù): 688次
    提 供 商: 研域(上海)化學(xué)試劑有限公司 資料大小:
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    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒
    用 途:
    人RBP-4 ELISA試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織、緩沖液中細(xì)胞上清液及各種體液中的RBP-4 。本試劑盒可以檢測(cè)天然和重組的RBP-4 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。

    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒試驗(yàn)原理:
    人RBP-4 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知RBP-4 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將RBP-4 和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中RBP-4 的濃度呈比例關(guān)系。

    試劑盒內(nèi)容及其配制
    試劑盒成份(2-8℃保存)    96孔配置    48孔配置    配制
    96/48人份酶標(biāo)板    1塊板(96T)    半塊板(48T)    即用型
    塑料膜板蓋    1塊    半塊    即用型
    標(biāo)準(zhǔn)品:80nmol/ml    1瓶(0.6ml)    1瓶(0.3ml)    按說(shuō)明書進(jìn)行稀稀
    空白對(duì)照    1瓶(1.0ml)    1瓶(0.5ml)    即用型
    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液    1瓶(5ml)    1瓶(2.5ml)    即用型
    生物素標(biāo)記的抗RBP-4抗體    1瓶(6ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
    親和鏈酶素-HRP    1瓶(10ml)    1瓶(5.0ml)    即用型
    洗滌緩沖液    1瓶(60ml)    1瓶(30ml)    按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
    底物A    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
    底物B    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
    終止液    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型

    自備材料
    1.蒸餾水。
    2.加樣器:5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
    3.振蕩器及磁力攪拌器等。

     

    安全性
    1.避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請(qǐng)盡快用水沖洗。
    2.實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
    3.不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。


    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒操作注意事項(xiàng)
    1.試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
    2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
    3.不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
    4.使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。
    5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
    6.洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
    7.底物A應(yīng)揮發(fā),避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
    8.加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
    9.按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

    樣品收集、處理及保存方法
    1、血清-----操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
    2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
    3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
    4、保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)備
    1.標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:
    80 nmol/ml    (6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
    40 nmol/ml    (5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    20 nmol/ml    (4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    10 nmol/ml    (3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    5.0 nmol/ml    (2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    2.5 nmol/ml    (1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)    100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    0 nmol/ml    (空白對(duì)照)    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

    2.洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。

    操作步驟
    1.使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
    2.根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
    3.加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時(shí)。
    4.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
    5.每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
    6.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
    7.每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
    8.取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
    9.在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

    建議使用的實(shí)驗(yàn)方案
        標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/ml)    
    A    80    80    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    B    40    40    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    C    20    20    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    D    10    10    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    E    5.0    5.0    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    F    2.5    2.5    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    G    0    0    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
    H    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品

    結(jié)果分析
    以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的RBP-4 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的RBP-4 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

    局限
    6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到的結(jié)果。

    人(Human)視黃醇結(jié)合蛋白-4(RBP-4) ELISA 檢測(cè)試劑盒性能
    1.靈敏度:zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
    2.特異性:不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
    3.重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

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